熒光定量PCR原理:

產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR最早稱TaqMan PCR，后來也叫Real-Time PCR，是美國PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來實現(xiàn)其定量功能的。其原理：隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計，熒光信號強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光強(qiáng)度信號，這樣我們就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。

一般而言，熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個階段：熒光背景信號階段，熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺期。在熒光背景信號階段，擴(kuò)增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加，PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，根據(jù)最終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段， PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，我們可以選擇在這個階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便，在實時熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個非常重要的概念：熒光閾值和 CT值。

PCR在分子克隆和DNA分析中有多種用途，下面就向大家介紹PCR實驗方法步驟:

方法

1：在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。     

10×PCR buffer                   

5 μl     dNTP mix （2mM）             

4 μl     引物1（10pM）                 

2 μl     引物2（10pM）                 

2 μl     Taq酶 （2U/μl）               

1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  

1 μl      加ddH2O至 50 μl 

定量PCR方法:

a、競爭法

選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個新內(nèi)切位點的外源競爭性模板。在同一反應(yīng)管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴(kuò)增（其中一個引物為熒光標(biāo)記）。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測定熒光強(qiáng)度，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。

b、內(nèi)參照法

在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強(qiáng)度，以內(nèi)標(biāo)為對照定量待檢測模板。

c、PCR－ELISA法

利用di高辛或生物素等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗di高辛或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，最終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實驗，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實現(xiàn)定量檢測目的。

實時熒光定量PCR：

實時熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點檢測的局限，實現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品Ct值的計算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實時熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個基礎(chǔ)之上的：

1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對數(shù)期），此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時間擴(kuò)增或同一時間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。

2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品進(jìn)行定量測定，因此，實時熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。

外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量最準(zhǔn)確，重現(xiàn)性最好的定量方法，已得到全世界的公認(rèn)，廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。

實驗過程:

一、試劑準(zhǔn)備

1. DNA模板

2．對應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計不同的引物）

3．10×PCR Buffer

4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM

5．Taq酶

二、操作步驟 

1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。

      10×PCR buffer             5μl

      dNTP mixl                 4μl

       引物1（10pM）               2μl

       引物2（10PM）              2μl

       Taq酶（2U/μl）            1μl

      DNA模板（50ng-1μg/μl） 1 μl

      加ddH2O至               50 μl

    視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。

2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。

3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。

4．PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。

三、注意事項

１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行。zui好設(shè)立一個專用的PCR實驗室。

２．純化模板所選用的方法對污染的風(fēng)險有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。

３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。

４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。

５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲存，從而確保實驗與實驗之間的連續(xù)性。

６．產(chǎn)品僅用于科研試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。

７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。

安息香二甲(DMPA) 24650-42-8甲苯三酮 標(biāo)準(zhǔn)品  CAS號：69004-03-1 100mg胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白4(IGFBP4)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)99%

安息香二甲(DMPA) 24650-42-8甲苯氟磺胺 標(biāo)準(zhǔn)品  CAS號：731-27-1 250mg血管內(nèi)皮生長因子D(VEGFD)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)99%

1-乙酰咪唑 2466-76-4 三甲苯草酮 標(biāo)準(zhǔn)品  CAS號：87820-88-0 250mg白介素11(IL11)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)98%

1-乙酰咪唑 2466-76-4 三唑酮 標(biāo)準(zhǔn)品  CAS號：43121-43-3 250mg血管內(nèi)皮生長因子C(VEGFC)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)98%

1-乙酰咪唑 2466-76-4三唑(異構(gòu)體A) 標(biāo)準(zhǔn)品  CAS號：250m'g白介素12B(IL12B)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)98%

魏因勒卜鏈接劑 247021-90-5三唑(異構(gòu)體A和B混合物) 標(biāo)準(zhǔn)品  CAS號：250mg血管內(nèi)皮生長因子C(VEGFC)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)98%

4-吡咯烷丁胺 24715-90-0 野麥畏 標(biāo)準(zhǔn)品  CAS號：2303-17-5 250mg白介素12B(IL12B)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)98%

6-甲氧基-2-四氫萘酮 2472-22-2苯黃隆 標(biāo)準(zhǔn)品  CAS號：82097-50-5 100mg血管內(nèi)皮生長因子B(VEGFB)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)95%

6-甲氧基-2-四氫萘酮 2472-22-2 三唑磷 標(biāo)準(zhǔn)品  CAS號：24017-47-8 250mg白介素12A(IL12A)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)95%

四正丁基硫酸銨 2472-88-0苯黃隆 標(biāo)準(zhǔn)品  CAS號：101200-48-0 100mg血管內(nèi)皮生長因子B(VEGFB)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)50wt%水溶液

1,3-二(4-氨苯氧基)苯 2479-46-1 標(biāo)準(zhǔn)品  CAS號：52-68-6 250mg尿激酶型纖溶酶原激活因子受體(uPAR)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)98%

1,3-二(4-氨苯氧基)苯 2479-46-1三氯吡氧乙酸標(biāo)準(zhǔn)品  CAS號： 55335-06-3 250MG尿激酶型纖溶酶原激活因子受體(uPAR)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)98%

三 24800-44-0十三嗎啉 標(biāo)準(zhǔn)品  CAS號：24602-86-6 100MG尿激酶型纖溶酶原激活因子(uPA)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)97%

三 24800-44-0布洛芬 標(biāo)準(zhǔn)品  CAS號：141517-21-7 100MG尿激酶型纖溶酶原激活因子(uPA)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)97%

Boc-Orn(Z)-OH 2480-93-5 氟菌唑 標(biāo)準(zhǔn)品  CAS號：68694-11-1 100mg血小板生成素(TPO)檢測試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗法)98%
貝氏貝諾孢子蟲探針法熒光定量PCR試劑盒2-[(三(羥甲基)甲基)氨基]-1-乙磺酸鈉Corin  心臟特異性絲氨酸蛋白酶抗體 100 ul

三羥基磺酸GPR55  蛋白偶聯(lián)受體55抗體 1 Kit

3-[N-[三(羥甲基)甲基]氨基]磺酸鈉LAP3  亮氨酸氨基肽酶3抗體 1 Kit

3-[ (N-三(羥甲基)甲氨基]-2-羥基磺酸LMW Kininogen/Kininogen 1  低分子量生長促進(jìn)因子抗體（激肽原1） 100 ul

3-三羥-2-羥基磺酸鈉KCNMB1/Maxi Potassium channel beta  鈣激活鉀通道蛋白β1抗體 100 ul

DIPSO單鈉鹽P2RX4  三磷酸腺苷門控陽離子通道蛋白抗體 100 ul

成套緩沖劑ATP6IP2  ATP酶H+轉(zhuǎn)運溶酶體輔助蛋白2抗體 20 ul

PBS磷酸鹽緩沖液Relaxin 1  松弛肽/松弛素抗體 100 ul

緩沖液Renalase  腎胺酶抗體 100 ul

磷酸鹽緩沖液SLC12A3/NCCT  鈉氯離子轉(zhuǎn)運蛋白抗體 100 ul

碳酸鹽緩沖液VNN1  血管非炎癥分子1抗體 100 ul

TRIS-HC1緩沖液AXUD1  轉(zhuǎn)化生長因子β誘導(dǎo)蛋白3抗體（半胱氨酸和絲氨酸富含核蛋白1） 100 ul

醋酸鈉醋酸緩沖液BS69/Adenovirus 5 E1A binding protein  腺病毒5結(jié)合蛋白BS69抗體(骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體相關(guān)分子1) 100 ul

鈉鹽酸緩沖液BTG3  高表達(dá)神經(jīng)上皮蛋白BTG3抗體 100 ul

砂鹽酸緩沖液BTG4  B細(xì)胞遷移基因4抗體 100 ul