定量PCR方法:

a、競(jìng)爭(zhēng)法

選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個(gè)新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競(jìng)爭(zhēng)性模板。在同一反應(yīng)管中，待測(cè)樣品與競(jìng)爭(zhēng)模板用同一對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增（其中一個(gè)引物為熒光標(biāo)記）。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競(jìng)爭(zhēng)性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個(gè)片段，而待測(cè)模板不被酶切，可通過(guò)電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開(kāi)，分別測(cè)定熒光強(qiáng)度，根據(jù)已知模板推測(cè)未知模板的起始拷貝數(shù)。

b、內(nèi)參照法

在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時(shí)，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長(zhǎng)度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開(kāi)來(lái)，分別測(cè)定其熒光強(qiáng)度，以?xún)?nèi)標(biāo)為對(duì)照定量待檢測(cè)模板。

c、PCR－ELISA法

利用di高辛或生物素等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗di高辛或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合物，最終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實(shí)驗(yàn)，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)目的。

PCR在分子克隆和DNA分析中有多種用途，下面就向大家介紹PCR實(shí)驗(yàn)方法步驟:

方法

1：在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o(wú)菌0.5ml離心管中。     

10×PCR buffer                   

5 μl     dNTP mix （2mM）             

4 μl     引物1（10pM）                 

2 μl     引物2（10pM）                 

2 μl     Taq酶 （2U/μl）               

1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  

1 μl      加ddH2O至 50 μl 

熒光定量PCR原理:

產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR最早稱(chēng)TaqMan PCR，后來(lái)也叫Real-Time PCR，是美國(guó)PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出來(lái)的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來(lái)實(shí)現(xiàn)其定量功能的。其原理：隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì)，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過(guò)一個(gè)循環(huán)，收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào)，這樣我們就可以通過(guò)熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。

一般而言，熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個(gè)階段：熒光背景信號(hào)階段，熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期。在熒光背景信號(hào)階段，擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋，無(wú)法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺(tái)期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)的增加，PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒(méi)有線性關(guān)系，根據(jù)最終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計(jì)算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段， PCR產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，我們可以選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便，在實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個(gè)非常重要的概念：熒光閾值和 CT值。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR：

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測(cè)的局限，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測(cè)一次熒光信號(hào)的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過(guò)對(duì)每個(gè)樣品Ct值的計(jì)算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR無(wú)需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個(gè)基礎(chǔ)之上的：

1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí)，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對(duì)數(shù)期），此時(shí)微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。

2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知樣品進(jìn)行定量測(cè)定，因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。

外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴(lài)的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時(shí)熒光定量PCR是迄今為止定量最準(zhǔn)確，重現(xiàn)性最好的定量方法，已得到全世界的公認(rèn)，廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測(cè)等諸多領(lǐng)域。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程:

一、試劑準(zhǔn)備

1. DNA模板

2．對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無(wú)到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）

3．10×PCR Buffer

4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM

5．Taq酶

二、操作步驟 

1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o(wú)菌0.5ml離心管中。

      10×PCR buffer             5μl

      dNTP mixl                 4μl

       引物1（10pM）               2μl

       引物2（10PM）              2μl

       Taq酶（2U/μl）            1μl

      DNA模板（50ng-1μg/μl） 1 μl

      加ddH2O至               50 μl

    視PCR儀有無(wú)熱蓋，不加或添加石蠟油。

2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。

3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長(zhǎng)期保存。

4．PCR的電泳檢測(cè)：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測(cè)。

三、注意事項(xiàng)

１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒(méi)有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行。zui好設(shè)立一個(gè)專(zhuān)用的PCR實(shí)驗(yàn)室。

２．純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡(jiǎn)單越好。

３．所有試劑都應(yīng)該沒(méi)有核酸和核酸酶的污染。操作過(guò)程中均應(yīng)戴手套。

４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌或高壓滅菌。

５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量?jī)?chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。

６．產(chǎn)品僅用于科研試劑或樣品準(zhǔn)備過(guò)程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。

７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開(kāi)，并且要充分混勻。

人1,3-二磷酸甘油酸(1,3-DPG)ELISA試劑盒CD79A Antibody20 ul

人1,25二羥基維生素D3(1,25-(OH)2D3/DVD/DHVD 3)ELISA試劑盒CD79A Antibody100 ul

雞蛋卵黃高磷蛋白磷酸肽(PPP)ELISA試劑盒Stathmin Antibody20 ul

雞卵黃免疫球蛋白(IgY)ELISA試劑盒Stathmin Antibody100 ul

倉(cāng)鼠甲狀腺結(jié)合球蛋白(TBG)ELISA試劑盒Phospho-Stathmin (Ser16) Antibody100 ul

倉(cāng)鼠核因子κB受體活化因子配基(RANKL)ELISA試劑盒CACYBP Antibody100 ul

倉(cāng)鼠基質(zhì)金屬蛋白酶9/明膠酶B(MMP-9/Gelatinase B) ELISA試劑盒Phospho-CaMKII (Tyr231) Antibody100 ul

倉(cāng)鼠組織蛋白酶K(cath-K)ELISA試劑盒CaMKII-α Antibody100 ul
路鄧葡萄球菌探針?lè)晒舛?/font>PCR試劑盒硫酸茚地那韋0.625-40ng/mlCfd|ADN|Adipsin|DF|PFD|Factor D|Properdin Factor D Esterase

他唑巴坦鈉 1.563-100ng/mlFga

他唑巴坦鈉 (標(biāo)準(zhǔn)品)0.312-20pmol/mlFgg

D-環(huán)絲氨酸1.56-100ng/mlFgb

D-環(huán)絲氨酸(標(biāo)準(zhǔn)品)15.6-1000pg/mlLrp2|gp330|Megalin|LRP-2|Glycoprotein 330

鹽酸四環(huán)素0.156-10ng/mlALCAM|CD166|MEMD|activated leucocyte cell adhesion molecule|CD166 antigen

鹽酸四環(huán)素(標(biāo)準(zhǔn)品)31.25-2000pg/mlCtgf|CCN2|HCS24|IGFBP-8|NOV2|CCN2IGFBP-8|HCS24|Hypertrophic chondrocyte-specific protein 24|IBP-8|IGF-binding protein 8|IGFBP8CCN family member 2|Insulin-like growth factor-binding protein 8|MGC102839

嘌呤霉素二鹽酸鹽0.156-10ng/mlCxcr1|IL8RA|CXC-R1|CXCR-1|CD128|CD181|IL-8R A|IL8R1|CKR-1|CMKAR1|CD181 antigen|C-C-CKR-1|IL8RBA|CDw128aC-C|chemokine(C-X-C motif) receptor 1|C-X-C chemokine receptor type 1|High affinity interleukin-8 receptor A|IL-8 receptor type 1|interleukin-8 receptor type 1|interleukin-8 receptor type A

羧芐青霉素鈉/羧芐西林鈉31.2-2000pg/mlTnfrsf8|CD30|CD30 antigen|KI-1|CD30L receptor|cytokine receptor CD30|Ki-1 antigen|Lymphocyte activation antigen CD30

羧芐西林鈉(標(biāo)準(zhǔn)品)0.156-10ng/mlCoro1a|Coronin-1A|CORO1A|TACO|Clipin-A|Tryptophan aspartate-containing coat protein|Coronin-like protein A|Coronin-like protein p57

芬苯達(dá)唑；苯硫咪唑0.156-10ng/mlEpor|EpoR|EPO-R

芬苯達(dá)唑；苯硫咪唑(標(biāo)準(zhǔn)品)62.5-4000pg/mlFGF9|fibroblast growth factor 9(glia-activating factor)|GAF|glia-activating factor|HBFG-9|HBGF-9|Heparin-binding growth factor 9|MGC119914|MGC119915|SYNS3

氯前列醇鈉(D型）78.125-5000pg/mlIGFBP-4|BP4|HT29-IGFBP|IBP4

氯前列醇鈉(DL型）0.313-20ng/mlGfap|FLJ45472|glial fibrillary acidic protein

鹽酸川芎嗪(標(biāo)準(zhǔn)品)78-5000pg/mlLif|LIF(Leukemia Inhibitory Factor)|CDF|D factor|DIA|differentiation inhibitory activity|differentiation stimulating factor|Differentiation-stimulating factor|Emfilermin

Polyphyllin D腺病毒3檢測(cè)試劑盒20mg

 小鼠淋巴瘤細(xì)胞英文名稱(chēng)：EL4.IL-2

卡維地洛相關(guān)物質(zhì)A標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格：規(guī)格：人類(lèi)泛素蛋白ATG12(Ubiquitin-like protein ATG12)Polyclonal Antibody 0.2ml

LAC/LA(Human lupus anticoagulant) ELISA Kit  人狼瘡抗凝抗體CAS號(hào)：右旋糖酐分子量D6糖異構(gòu)酶檢測(cè)試盒1KUHuman/人Elisa試盒32222063

腺病毒36抗體檢測(cè)試劑盒20mg

Bacto酵母浸粉(BD原裝) 質(zhì)量規(guī)格：Bacto;BD212750 Yeast extract

成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子6(FGF6)檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法)重組人 MKK6 / MEK6 / MAP2K6 蛋白 (207 Asp, 211 Asp)現(xiàn)貨促銷(xiāo)1.05398.0500

人超敏C反應(yīng)蛋白（hsCRP）ELISA Kit AHNAK2  AHNAK核蛋白2抗體規(guī)格:96T/48TCefazolin規(guī)格:1．5g補(bǔ)體蛋白3檢測(cè)試盒20mg大鼠海綿體平滑肌細(xì)胞1x10^6cells

98%250g25g多酚化酶(菇)Thrombomodulin antibody

對(duì)茴香(>99.0%(GC)(T)) 質(zhì)量規(guī)格：>99.0%(GC)(T) p-Anisic Acid

高端化學(xué), 漂白土粉

≥6,000 units/mg protein100g1g多酚化酶(菇)VEcadherin antibody

 PIEC(豬髖動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞 )大豆慢生根瘤菌 Bradyrhizobium japonicum

高端化學(xué), 皂土

酶活力≥30000u/g500g5g神經(jīng)氨酶（梭）CN1A

9-蒽羧(>97.0%(GC)(T)) 質(zhì)量規(guī)格：>97.0%(GC)(T) 9-Anthracenecarboxylic Acid

高端化學(xué), 三基氧化膦