Ⅰ. 概述：Cell Counting Kit-8 (CCK-8) 利用了Dojindo開發(fā)的水 溶性四唑鹽 — WST?-8 (2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3- (4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽)，它 在電子載體1-Methoxy PMS存在的情況下能夠被還原 成水溶性的甲臜染料。 CCK-8溶液可以直接加入到細胞樣品中；不需要預配 各種成分。CCK-8法是用于測定細胞增殖或毒性實驗 中活細胞數目的一種高靈敏度，無放射性的比色檢測 法。WST?-8被細胞內脫氫酶氧化還原后生成的橙黃 色甲臜染料能夠溶解在組織培養(yǎng)基中，生成的甲臜量 與活細胞數量成正比。

Cell Counting Kit-8（CCK-8試劑盒）是由同仁化學研究所（Dojindo）開發(fā)的檢測細胞增殖、細胞毒性的試劑盒，為MTT法的替代方法，試劑盒中采用自己開發(fā)的水溶性四唑鹽-WST-8，在美國，歐洲等國家地區(qū)均持有專利，同仁化學研究所于2006年在中國獲得了WST-8的注冊商標。 
CCK-8法與普通的MTT法相比，具有顯著特點：
★靈敏度高，數據可靠，重現性好
★操作簡便，省時省力
★水溶性，不需要換液，尤其適合于懸浮細胞
★無需放射性同位素和有機/溶劑，對細胞毒性低
★為1瓶溶液，毋需預制，即開即用
★適合于高通量藥物篩選
CCK-8用途：藥物篩選、細胞增殖測定、細胞毒性測定、腫瘤藥敏試驗
CCK-8試劑盒在國內知名科研院所、重點大學、三甲醫(yī)院被廣泛應用，國際認可度高，使用CCK-8發(fā)表的中外文獻達600多篇，其中截止08年底SCI影響因子IF＞10分的論文有37篇，最高IF26.5分
[Heterozygosity with respect to Zfp148 causes complete loss of fetal germ cells during mouse embryogenesis,Nature Genetics 33, 172 - 176 (01 Feb 2003)]
 CCK-8試劑與MTT等方法靈敏度比較

 

CCK-8試劑毒性：CCK-8和其他檢測方法對比可以得出——CCK-8對細胞幾乎無毒性，不傷害細胞，細胞可重復利用

Ⅲ. 注意事項

1. 首次實驗時，建議參考文獻上的實驗條件或做預實驗摸索接種細胞的數量和加入CCK-8試劑后的顯色時間。方法：取已知細胞數量的細胞懸液加入到培養(yǎng)板中，然后用培養(yǎng)基依次等比例稀釋成一個系列濃度的細胞懸液，細胞培養(yǎng)一段時間后加CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)，過0.5-1 h，從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)板觀察顏色是否發(fā)生明顯變化？如果沒有，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，過1 h左右從培養(yǎng)箱中拿出觀察顏色變化?6?8?6?8直到顏色發(fā)生明顯梯度變化后，用酶標儀進行測定，并記錄下反應時間。

2. 根據實驗設計的天數，若是細胞增殖實驗，一般選取O.D.值在0.2-1.0 (扣除空白后) 范圍內的細胞數量；若是做藥物對細胞的毒性實驗，一般選取O.D.值在1.0-2.0 (扣除空白后) 范圍內的細胞數量。但也存在有部分細胞的O.D.值達不到1.0的情況。

3. 接種時請充分混勻細胞懸液，保證每孔接種細胞數量接近一致。如果細胞容易聚團，建議每接種幾個孔后，將細胞懸液重新混勻后再接種。

4. 培養(yǎng)時培養(yǎng)板邊緣孔內的培養(yǎng)基易揮發(fā)，為了減少誤差，建議培養(yǎng)板邊緣孔只加培養(yǎng)基，而不作為指標檢測孔。

5. 為了減少差異，請盡量采用多通道移液器。加入CCK-8時，建議45°斜貼培養(yǎng)板孔壁加樣，切勿直接插入培養(yǎng)基液面下，否則容易產生氣泡，影響檢測結果。

6. CCK-8試劑加入時需快速，盡可能減少試劑在移液器上的殘留所帶來的誤差，也可用培養(yǎng)基稀釋CCK-8試劑1倍，混勻后每孔加入20 ?8?6l，減小復孔間誤差。

7. 加完CCK-8后，請輕微傾斜培養(yǎng)板使培養(yǎng)基覆蓋培養(yǎng)板孔壁上殘留的CCK-8，并輕輕拍打培養(yǎng)板使CCK-8和培養(yǎng)基混勻。如果培養(yǎng)基需要換液，可將CCK-8與培養(yǎng)基按照1:10的比例混勻后添加。

8. 試劑中所含的WST?-8會與還原劑反應，生成WST?-8甲臜從而影響實驗結果。若實驗中所采用的藥物具有還原性，請在加入CCK-8前進行換液。

9. 若細胞培養(yǎng)時間較長，培養(yǎng)基顏色、pH值等條件易發(fā)生改變，此時加入CCK-8前需換液。

10. 如果樣品為高渾濁度的細胞懸液，建議采用雙波長進行測定，檢測波長450-490 nm，600-650 nm作為參比波長。

11. 由于CCK-8幾乎無細胞毒性，細胞可在實驗后進行中性紅法或結晶紫法等其他實驗。

12. 如果要測定細胞的具體數量，建議先做標準曲線。

 

Ⅳ. 參考文獻

1. Kie Kyon Huang, et al., Genomic and Epigenomic Profiling of High-Risk Intestinal Metaplasia Reveals Molecular Determinants

of Progression to Gastric Cancer, Cancer Cell, 2018, 33, 1-14

2. TaChung Yu, et al., Fusobacterium nucleatum Promotes Chemoresistance to Colorectal Cancer by Modulating Autophagy,

Cell, 2017, 170(3), 548-563

3. Kun Chen, et al., Methyltransferase SETD2-Mediated Methylation of STAT1 Is Critical for Interferon Antiviral Activity,

Cell, 2017, 170(3), 492-506

4. Liang Huang, et al., Integrated genomic analysis identifies deregulated JAK/STAT-MYC-biosynthesis axis in aggressive

NK-cell leukemia, Cell Research, 2017, 1-15

5. Christian Münchet, et al., Mitochondrial unfolded protein response controls matrix pre-RNA processing and translation,

Nature, 2016, 534, 710-713

6. Kazuhide Hayakawa, et al., Transfer of mitochondria from astrocytes to neurons after stroke,

Nature, 2016, 535, 551-555

7. Yoon Kyung Choi, et al., Dual effects of carbon monoxide on pericytes and eurogenesis in traumatic brain injury,

Nature medicine, 2016, 22(11), 1335-1341

8. Akihiro Fujimoto, et al., Whole-genome mutational landscape and characterization of noncoding and structural mutations

in liver cancer, Nature genetics, 2016, 48(5), 500-509

9. Jian Zheng, et al., Pancreatic cancer risk variant in LINC00673 creates a miR-1231 binding site and interferes with PTPN11

degradation, Nature genetics, 2016, 48(7), 747-757

10. Wen-Lian Chen, et al., Enhanced Fructose Utilization Mediated by SLC2A5 Is a Unique Metabolic Feature of Acute Myeloid

Leukemia with Therapeutic Potential, Cancer Cell, 2016, 30, 779-791