描述：甘油三酯是由甘油和脂肪酸酯化而成，是血脂的主要成分，也是機體重要的供能物質。高甘油三酯和高膽固醇血癥是臨床常見的高脂血癥，與許多疾病相關。與血漿甘油三酯測定相比，實體組織和細胞的甘油三酯測定并非易事。本試劑盒避免了有毒的氯仿甲醇提取、繁雜的氮氣吹干和脂質復溶等步驟，采用高效能試劑進行組織細胞裂解和甘油三酯抽提，而且優(yōu)化了GPO Trinder酶學反應組分和操作步驟。簡單易行、靈敏度高檢測范圍為 20-2000μmol/L?？捎糜跍y量動植物組織細胞、樣品中的甘油三酯含量。

原理：（1）脂肪酶分解血清中的甘油三酯為甘油；（2）甘油激酶將甘油磷酸化為3-磷酸甘油；（3）3-磷酸甘油被甘油磷酸氧化酶氧化產(chǎn)生過氧化氫；在過氧化物酶作用下生色底物轉化為苯醌亞胺，其光密度值與甘油濃度成正比。

適用范圍：適用于動物實體組織、培養(yǎng)細胞樣品中甘油三酯含量的測定。

組成 ： （105次測定）

(1)    裂解液  100 ml

(2)    R1試劑 16 ml

(3)    R2試劑  4 ml    

(4)    4 mmol/L甘油標準品1 ml

4 oC保存  6個月有效

所需設備：酶標儀、生化分析儀或721、722型可見光分光光度計。最佳工作波長550nm，如無此波長建議優(yōu)先選用570nm、次選530、490nm。

操作步驟：

一 組織細胞裂解：（在裂解前，組織或者細胞用PBS洗滌兩次以去除甘油）

1.原代脂肪細胞：2000g，5分鐘離心收集細胞。建議每100 μl壓積（Packed Cell Volume）脂肪細胞加入1ml裂解液，震蕩裂解，而后室溫靜

置10分鐘。

2.分化脂肪細胞或非脂肪細胞：可先用胰酶消化、離心收集細胞而后進行裂解，也可直接在培養(yǎng)皿內進行裂解。通常情況下，(6孔板單孔約為2x10⁶ 個細胞，75cm²瓶約為1x10⁶ 個細胞)可按比例每1x10⁶ 個細胞加入0.1ml裂解液，混勻后室溫靜置10分鐘。

3.動物組織：離心管精確稱重，加入組織塊后再稱重，二者相減(即減量稱重法)計算組織重量(約50mg)。強烈建議按比例每1mg組織加20μl裂解液以減少樣品間蛋白和脂質含量變異而產(chǎn)生的誤差。強烈建議裂解液用量在1ml左右，保證有效的勻漿裂解與脂質提取。用電動高速勻漿器或手動玻璃勻漿器破碎組織。（不推薦超聲方法，因其不能完全和均勻破碎。應根據(jù)預實驗調整初始的組織細胞加入量），勻漿后靜置10分鐘。

二. 裂解液處理：

1.取適量上清液轉移到1.5ml離心管中，進行步驟2的操作。余下的裂解液可用BCA法蛋白定量試劑盒(#P1511)進行蛋白定量或－20oC儲存。

2.70oC 加熱10分鐘，組織量多時可能出現(xiàn)絮狀沉淀。

3.室溫2000rpm離心5分鐘，上層清液即可用于酶學測定。

三．工作溶液配制：

按4:1比例，取4 ml試劑R1與1 ml試劑R2混合即可，立即使用或4oC保存<1天，變色棄去。

四．標準品稀釋：

用蒸餾水、生理鹽水或與樣品緩沖液一致的液體，將4 mM甘油標準品倍比稀釋為1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125 μmol/L，通常取其中4~6管即可，注意設置0濃度對照反應管。

五 甘油三酯濃度測定：

1.  參見下表進行加樣。以96孔板為例，待測樣品體積可在5、10、20μl之間，推薦以10μl為起始加樣量。如果樣品測量值超出線性范圍，可進行適當稀釋，最后根據(jù)稀釋倍數(shù)計算濃度。

2. 37oC或25oC反應 15分鐘。反應平衡后顏色在60分鐘內穩(wěn)定。

3. 先用蒸餾水+工作液的空白管調零，然后測定各管OD值。

4. 繪制標準曲線并計算甘油三酯濃度。

       附Excel作圖步驟：各標準管OD值為y軸，標準品濃度為x軸。(1)鼠標左鍵圈住數(shù)據(jù)，點擊做圖向導，選擇-散點圖-，點擊-完成-。(2)鼠標右鍵點圖上的某一點，點擊-添加趨勢線-，點擊-選項-，點擊-顯示公式-和-R²值-。

5. 以每mg蛋白濃度或細胞數(shù)校正甘油三酯含量。

加樣比例（檢測范圍20-2000μmol/L）

（可對樣品和工作液比例進行微量調整）

說明：

1. 維生素C>0.18g/L、血紅蛋白>2g/L、膽紅素>0.25g/L、強還原劑二硫蘇糖醇、巰基乙醇等會干擾測。高濃度EDTA會干擾測定。

2. 樣本即使保存在-20oC的環(huán)境下，甘油三酯也會自發(fā)水解。因此建議樣品4oC保存時間應短于24小時，當-70oC保存時，也應不超過1個月。

3. 如果室溫較低，應延長反應時間或在37oC進行反應。

4. 不同類型組織和細胞內甘油三酯含量差別很大，應根據(jù)預實驗調整初始的裂解液的加入量。對于脂肪組織而言，一般來說裂解液用量在10-20mg/ml即可。

參考文獻：

1. Trinder, P. (1969). Ann. Clin. Biochem. 6: 24 – 27.

2.Barham D and Trinder P. (1972). Analyst 97: 142 –1. 145