熒光假單胞菌染料法熒光定量PCR試劑盒 

                     Pseudomonas fluorescens

產(chǎn)品及特點(diǎn)： 

熒光定量PCR所使用的熒光化學(xué)可分為兩種：熒光探針和熒光染料。而熒光定量 PCR 的方法相應(yīng)的可分為特異類和非特異類兩類，特異性檢測(cè)方法是在PCR反應(yīng)中利用標(biāo)記熒光染料的基因特異寡核苷酸探針來(lái)檢測(cè)產(chǎn)物；而非特異性檢測(cè)方法是在在PCR反應(yīng)體系中，加入過(guò)量熒光染料，熒光染料特異性地?fù)饺?/font>DNA雙鏈后，發(fā)射出熒光信號(hào)。前者由于增加了探針的識(shí)別步驟，特異性更高，但后者則簡(jiǎn)便易行，為此本公司開(kāi)發(fā)了簡(jiǎn)單快捷的熒光假單胞菌染料法熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒。

熒光假單胞菌染料法熒光定量PCR試劑盒產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)：

1.隨時(shí)可用。

2.優(yōu)化的緩沖液可增強(qiáng)特異性并減少引物二聚體的形成。

3.高靈敏度，特異性和可靠性。

4.為不同的qPCR儀器提供了被動(dòng)參考染料。

它具有下列特點(diǎn)：

1. 即開(kāi)即用，用戶只需要提供病毒樣品。

2. 根據(jù)熒光假單胞菌保守序列設(shè)計(jì)的專一性引物，與相關(guān)病毒無(wú)交叉反應(yīng)。

3. 靈敏度可以達(dá)到幾百拷貝/反應(yīng)。

4. 一管式熒光定量 PCR 檢測(cè)，避免后續(xù)污染。

5. 本試劑盒足夠 50 次 20μL 反應(yīng)體系的熒光定量 PCR。

6. 本產(chǎn)品只適用于科研，不能用于臨床診斷。

熒光假單胞菌染料法熒光定量PCR試劑盒規(guī)格及成分

運(yùn)輸及保存： 低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期一年。

自備試劑 ：DNA 模板、10×ROX（根據(jù)機(jī)型決定，具體見(jiàn)使用方法）。

熒光假單胞菌染料法熒光定量PCR試劑盒使用方法 

一、稀釋 PCR 陽(yáng)性對(duì)照（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例）

1. 注意：由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬(wàn)不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽(yáng)性對(duì)照，只提供可以直接使用的 DNA 片段作為陽(yáng)性對(duì)照。

2. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。

3. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液（最好用帶芯槍頭，下同）。

4. 在 7 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照，充分震蕩 1 分鐘，得1×10E7 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。

5. 換槍頭，在 6 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。

6. 換槍頭，在 5 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照到 5 號(hào)管中，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。

7. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。

二、樣品DNA的制備 

8. 如果有N個(gè)樣品，必須設(shè)置N+2個(gè)提取，多出的一個(gè)是PC（樣品制備陽(yáng)性對(duì)照），一個(gè)是NC（樣品制備陰性對(duì)照）?？梢杂?10μL上步制備的PCR 陽(yáng)性對(duì)照的第4號(hào)（濃度為 1×10E4 拷貝/μL，10μL相當(dāng)于1萬(wàn)拷貝）或第5號(hào)（濃度為1×10E5拷貝/μL，10μL 相當(dāng)于10萬(wàn)拷貝）再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為NC。如果每次制備需要200μL樣品，則PC和NC的體積也必須是200μL。

9. 用自選方法純化樣品的DNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)病毒DNA提取試劑盒兼容。也可以選購(gòu)本公司的一管式病毒DNAout 或其升級(jí)版柱式病毒DNAout。本試劑盒免費(fèi)贈(zèng)送15次一管式病毒DNAout。

三、設(shè)置qPCR反應(yīng)（20μL體系，在樣品制備室進(jìn)行）

10. 如果只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+9個(gè)PCR管，其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)

樣品，1個(gè)用于PCR陰性對(duì)照，6個(gè)用于PCR陽(yáng)性對(duì)照。如果做2-3次重復(fù)，則反應(yīng)設(shè)置數(shù)量相應(yīng)增加2或3倍。

11. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照，并且陽(yáng)性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好后最后加）：

注:僅 ABI7500、7700 和 7900 儀器需要使用 ROX 作為對(duì)照，其他熒光PCR儀器（如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480）不需要使用 ROX，則用水替代。

12. 蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行PCR（具體PCR參數(shù)可以根據(jù)儀器不同而自行優(yōu)化）。

13. 數(shù)據(jù)采集

具體操作按所用儀器推薦的流程進(jìn)行。本產(chǎn)品中所含的熒光染料在不結(jié)合 DNA 時(shí)，最大吸收光譜在 471 nm，結(jié)合 DNA 時(shí)的最大吸收光譜在 500 nm，最大發(fā)射光譜在 530 nm。信號(hào)采集可以設(shè)置在復(fù)性或延伸步驟。

四、數(shù)據(jù)處理

14. 如果把本試劑盒用于定量檢測(cè)，則以陽(yáng)性對(duì)照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 DNA 濃度的log 值，再推算出其濃度。

15. 如果把本試劑盒用于定性檢測(cè)，只判斷陽(yáng)性或陰性，則陰性對(duì)照 Ct 必須大于或等于 40。陽(yáng)性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，有典型擴(kuò)增曲線，Ct 值應(yīng)該小于或等于30。對(duì)待測(cè)樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽(yáng)性。如果在 35-40 之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的 Ct 值如果大于或等于 40 則為陰性，如果小于 40，則為陽(yáng)性。

五、熒光定量PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論 ：

1、熒光定量PCR線性關(guān)系成立的條件分析 、熒光定量PCR線性關(guān)系成立的條件分析。

左圖橫坐標(biāo)是PCR循環(huán)次數(shù)，縱坐標(biāo)是總的熒光強(qiáng)度Rn,改圖反映的是各個(gè)樣品隨著 左圖橫坐標(biāo)是PCR循環(huán)次數(shù)，縱坐標(biāo)是總的熒光強(qiáng)度Rn,改圖反映的是各個(gè)樣品隨著 每輪PCR反應(yīng)，其總的熒光量的實(shí)時(shí)變化；右圖橫坐標(biāo)也是PCR循環(huán)次數(shù)，縱坐標(biāo)是 每輪PCR反應(yīng)，其總的熒光量的實(shí)時(shí)變化；右圖橫坐標(biāo)也是PCR循環(huán)次數(shù)，縱坐標(biāo)是 總的熒光強(qiáng)度與熒光本底的差值RT RB即△Rn的對(duì)數(shù)，在右圖中確定閾值線，該直 總的熒光強(qiáng)度與熒光本底的差值RT –RB即△Rn的對(duì)數(shù)，在右圖中確定閾值線，該直 線上所有樣品的RT RB的對(duì)數(shù)都相同，熒光定量PCR的線性關(guān)系才會(huì)成立。 線上所有樣品的RT –RB的對(duì)數(shù)都相同，熒光定量PCR的線性關(guān)系才會(huì)成立。