牛病毒性腹瀉病毒染料法熒光定量 RT-PCR 試劑盒

                           Bovine Viral Diarrhea Virus SYBR qRT-PCR Kit

產(chǎn)品及特點(diǎn)




牛 病 毒 性 腹 瀉 - 粘膜病 （ Bovine viral diarrhea-mucosal disease ， BVD-MD）是由牛病毒性腹瀉病毒（Bovine viral diarrhea-mucosal disease virus，BVDV）引起的以粘膜發(fā)炎、糜爛、壞死和腹瀉等特征為主的疾病。該病 在世界各地廣泛流行和傳播，一些畜牧業(yè)發(fā)達(dá)的國家尤其嚴(yán)重。因此，BVDV 的 快速準(zhǔn)確鑒定，對該病的預(yù)防和檢疫有著重要作用。為此本公司開發(fā)了本產(chǎn)品， 采用 qRT-PCR 技術(shù)檢測疑似感染動物血清或組織中的 BVDV。它具有下列特點(diǎn)：

1. 一站式，用于不需要單獨(dú)準(zhǔn)備每種成分，包括引物和對照。

2. 根據(jù)牛病毒性腹瀉病毒的保守基因序列設(shè)計的引物，具有良好的特異性。

3. 基于染料法 qRT-PCR 檢測，靈敏度比常規(guī) RT-PCR 高 10-100 倍，可以達(dá) 到至少 1000 拷貝/反應(yīng)。

4. 使用一管式 qRT-PCR 技術(shù)，RT 和 PCR 兩步在一個試管內(nèi)完成，不需要中 間轉(zhuǎn)移樣品，降低了操作誤差和可能的污染。

5. 本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的 RT-PCR，只能用于科研，不能用于臨床。 

規(guī)格及成分

成分	編號	十孔盒包裝
2×qPCR MagicMix	A	500μL（棕色管）
熒光 PCR 專用模板稀釋液	B	1 mL（黃蓋）
牛病毒性腹瀉病毒PCR 引物混合物	C	100μL（白蓋）
牛病毒性腹瀉病毒PCR 陽性對照(1×10E8 拷貝/μL)	D	50μL（紅蓋）
DNA 病毒裂解液（試用裝）	E	15 次（9 mL）
使用手冊	F	1 份

運(yùn)輸及保存： 低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期一年。

自備試劑 ：DNA 模板、10×ROX（根據(jù)機(jī)型決定，具體見使用方法）。

使用方法

一、稀釋 PCR 陽性對照（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）

1. 注意：由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供可以直接使用的 DNA 片段作為陽性對照。

2. 標(biāo)記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。

3. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液（最好用帶芯槍頭，下同）。

4. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照，充分震蕩 1 分鐘，得1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。

5. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。

6. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照到 5 號管中，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。

7. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。

二、樣品DNA的制備

8. 如果有N個樣品，必須設(shè)置N+2個提取，多出的一個是PC（樣品制備陽性對照），一個是NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂?span lang="EN-US"> 10μL上步制備的PCR 陽性對照的第4號（濃度為 1×10E4 拷貝/μL，10μL相當(dāng)于1萬拷貝）或第5號（濃度為1×10E5拷貝/μL，10μL 相當(dāng)于10萬拷貝）再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為NC。如果每次制備需要200μL樣品，則PC和NC的體積也必須是200μL。

9. 用自選方法純化樣品的DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒DNA提取試劑盒兼容。也可以選購本公司的一管式病毒DNAout 或其升級版柱式病毒DNAout。本試劑盒免費(fèi)贈送15次一管式病毒DNAout。

三、設(shè)置qPCR反應(yīng)（20μL體系，在樣品制備室進(jìn)行）

10. 如果只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+9個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個

樣品，1個用于PCR陰性對照，6個用于PCR陽性對照。如果做2-3次重復(fù)，則反應(yīng)設(shè)置數(shù)量相應(yīng)增加2或3倍。

11. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加）：

成分	樣品管 N+2 個	PCR 陰性 對照管	PCR 陽性 對照管（2-7 管）
2×qPCR MagicMix （棕色管）	10 μL	10 μL	各 10 μL
牛病毒性腹瀉病毒PCR 引物混合液（白蓋）	2 μL	2 μL	各2 μL
自備 10×ROX (見注)	2 μL	2 μL	2 μL
N+2 待測樣品 DNA 模板	6 μL	不加	不加
第 7 步所得 PCR 陽性對照稀釋液（2-7 號）	不加	不加	各 6μL（2 號樣到 2 號管，3 號樣到 3 號管…）

注:僅 ABI7500、7700 和 7900 儀器需要使用 ROX 作為對照，其他熒光PCR儀器（如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480）不需要使用 ROX，則用水替代。

12. 蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行PCR（具體PCR參數(shù)可以根據(jù)儀器不同而自行優(yōu)化）。

過程	溫度	時間
預(yù)變性	92℃	5 分鐘
PCR 反應(yīng)（35 個循環(huán)）	94℃	60 秒
	50℃	60 秒
	72℃	60 秒

13. 數(shù)據(jù)采集

具體操作按所用儀器推薦的流程進(jìn)行。本產(chǎn)品中所含的熒光染料在不結(jié)合 DNA 時，最大吸收光譜在 471 nm，結(jié)合 DNA 時的最大吸收光譜在 500 nm，最大發(fā)射光譜在 530 nm。信號采集可以設(shè)置在復(fù)性或延伸步驟。

四、數(shù)據(jù)處理

14. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 DNA 濃度的log 值，再推算出其濃度。

15. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴(kuò)增曲線，Ct 值應(yīng)該小于或等于30。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的 Ct 值如果大于或等于 40 則為陰性，如果小于 40，則為陽性。

特別提示：本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實(shí)驗(yàn)，嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！

五、熒光定量PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論 ：

1、熒光定量PCR線性關(guān)系成立的條件分析 、熒光定量PCR線性關(guān)系成立的條件分析。

左圖橫坐標(biāo)是PCR循環(huán)次數(shù)，縱坐標(biāo)是總的熒光強(qiáng)度Rn,改圖反映的是各個樣品隨著 左圖橫坐標(biāo)是PCR循環(huán)次數(shù)，縱坐標(biāo)是總的熒光強(qiáng)度Rn,改圖反映的是各個樣品隨著 每輪PCR反應(yīng)，其總的熒光量的實(shí)時變化；右圖橫坐標(biāo)也是PCR循環(huán)次數(shù)，縱坐標(biāo)是 每輪PCR反應(yīng)，其總的熒光量的實(shí)時變化；右圖橫坐標(biāo)也是PCR循環(huán)次數(shù)，縱坐標(biāo)是 總的熒光強(qiáng)度與熒光本底的差值RT RB即△Rn的對數(shù)，在右圖中確定閾值線，該直 總的熒光強(qiáng)度與熒光本底的差值RT –RB即△Rn的對數(shù)，在右圖中確定閾值線，該直 線上所有樣品的RT RB的對數(shù)都相同，熒光定量PCR的線性關(guān)系才會成立。 線上所有樣品的RT –RB的對數(shù)都相同，熒光定量PCR的線性關(guān)系才會成立。